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韩春雨的结果能否重复?数据说话!

       继20名中外学者之后Protein Cell该杂志发表的实验数据表明,韩春雨的论文(以下简称韩国论文)的实验结果不能重复NgAgo原始论文的Nature Biotechnology (天然生物技术,NBT)几天前,该杂志还发表了一篇同行评论文章(peer reviewed)无法检测到这个名字DNA介导的NgAgo基因编辑Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute )作者来自三个在韩国、德国和美国有丰富基因编辑研究经验的研究小组。该杂志还发布了编辑部的关注,表达了对韩国论文可重复性的担忧,并表示将在2017年1月底前与原论文作者保持联系,完成调查。许多媒体已经对编辑部的关注做了很多报道,这里我将详细解释这个重复NgAgo学术论文基因编辑失败的实验设计和结果。

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       这三个研究小组独立进行了韩国论文的重复实验,合成了文章中使用的5‘磷酸化gDNA(guide DNA,可以介导韩国论文的描述NgAgo编辑到目标基因位点),由韩国提供Addgene(质粒共享平台)NgAgo对于基因组,表达质粒感染了韩国论文中使用的细胞系DNA测试了编辑NgAgo它将发挥作用gDNA在介导下,定位在目标基因组位点并引起DNA双链断裂,导致目标位点出现小片段DNA插入或缺失突变(insertion and deletion,indel)。尽管多次尝试并试图优化条件,这三个研究组都无法检测到任何内源基因发生了NgAgo介导突变。

       首先Cathomen研究小组试图重复韩国论文的中心Hela和293T细胞中利用NgAgo编辑质粒GFP(绿色荧光蛋白)基因,从而GFP表达实验。尽管使用了相同的实验系统和步骤,但使用了韩国论文gDNA(G3、G4),Cathomen研究小组没有检测到显著的GFP降低。

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       图为质粒表达GFP降低水平。可见使用CRISPR系统(Cas9)样品中有明显的GFP表达减少(约15倍)NgAgo使用韩国提供的组Addgene质粒(AgoN1)还是他们自己克隆的质粒(AgoN2),均未检测到GFP降低。

       他们进一步尝试在基因组中编辑和整合GFP也没有发现基因GFP显著降低表达。

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       Ekker研究组在HEK293、Hela和K562在细胞中进行了检查NgAgo内源基因DYRK1A编辑使用了韩国论文中使用的五篇文章gDNA(G5、G6、G10、G12和G13)。目标基因突变尚未在所有样品中检测到。

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       I这五篇文章部分标注gDNA在目标基因上所处的位置。II部分是DNA每种颜色的峰值表示一个测序图DNA碱基(红色T,绿色A,蓝色C,黑色G)。可见无论用哪一个gDNA和NgAgo测序结果与普通未编辑细胞相同,意味着没有基因编辑被检测到( DNA序列没有改变)。

       Kim研究小组针对韩国论文中的四个内源基因位点(DYRK1A,EMX1,GATA4,and GRIN2B)都进行了编辑实验,尝试了两种方法:脂质体转染和电穿孔转染NgAgo表达质粒和gDNA导入细胞。扩大不同样品中基因组的目标位点,并使用深度测序来确定突变频率。在所有的NgAgo高于测序误差的样品未检测到(0.1%)的目标位点DNA作为阳性对照,序列变化CRISPR样品(SpCas9,sgRNA)然后检测到高效的基因编辑。下图只显示了两个位点的数据。

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